Πανω
PCR

PCR (Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης)

Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR – Polymerase Chain Reaction) είναι μια σχετικά πρόσφατα ανακαλυφθείσα τεχνική εξέλιξη της μοριακής βιολογίας, η σπουδαιότητα της οποίας έχει αναγνωρισθεί με το βραβείο Nobel. Σήμερα η PCR θεωρείται μία από τις πιο επαναστατικές και σημαντικές επιστημονικές ανακαλύψεις του 20ου αιώνα, η οποία έχει αλλάξει ριζικά την μελέτη του γενετικού υλικού και έχει συμβάλει σημαντικά στην ευρεία εφαρμογή της μοριακής βιολογίας στην ιατρική έρευνα και διάγνωση.

Αποτελεί μια απλή, ταχεία, επιλεκτική και εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδο πολλαπλασιασμού του γενετικού υλικού ενός οργανισμού, η οποία πραγματοποιείται με την βοήθεια του ένζυμου της πολυμεράσης και επαναλαμβανόμενους κύκλους τριών διαδοχικών αντιδράσεων. Με την PCR ακόμη και ένα μόνο μόριο DNA μπορεί να πολλαπλασιαστεί με ακρίβεια μέχρι και δισεκατομμύρια φορές μέσα σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα (μερικά λεπτά έως δυο ώρες).

Η τεχνολογία της PCR έχει πλέων γίνει ένα απαραίτητο ερευνητικό και διαγνωστικό εργαλείο για την καλυτέρευση της ανθρώπινης υγείας και της ποιότητας ζωής. Η εφαρμογές της εκτείνονται σε τρεις βασικούς άξονες:

  • Ανίχνευση και τυποποίηση εξωγενούς γενετικού υλικού παθογόνων οργανισμών, με κύρια έμφαση στους ιούς και μικρόβια.
  • Ανίχνευση της έκφρασης ενδογενούς γενετικού υλικού, που σχετίζεται με παθολογικές ή μη καταστάσεις.
  • Ανίχνευση γενετικών μεταλλαγών ή πολυμορφισμών ανθρώπινων γονιδίων, που σχετίζονται με την καρκινογένεση ή την κληρονομική προδιάθεση ασθενειών.

Εξειδικευμένα εργαστήρια Μοριακής Βιολογίας που εφαρμόζουν την PCR ως μία βασική διαγνωστική τεχνική έχουν πλέων επανδρώσει δημόσια καθώς και ιδιωτικά νοσοκομεία, ιατρεία, διαγνωστικά κέντρα σε όλο τον κόσμο.

Ένα μεγάλο πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι μπορεί να εφαρμοσθεί σε σχεδόν οποιοδήποτε βιολογικό υλικό, όπως αίμα, βιοψίες ιστών, τρίχα, σπέρμα, σάλιο, φρέσκους ιστούς, σε ιστούς μονιμοποιημένους καθώς και  σε αρχαίους ιστούς.

Κλινικές/Διαγνωστικες Xρήσεις της PCR

Η PCR εφαρμόζεται στην διερεύνηση ποικίλων και σημαντικών κλινικών ερωτημάτων. Με την χρήση της PCR σημαντική πρόοδος έχει ήδη γίνει στη διάγνωση λοιμωδών ασθενειών, στη διάγνωση γενετικών ασθενειών, στον προσδιορισμό της γενετικής ταυτότητας, στον προγεννητικό έλεγχο, στην ιατροδικαστική για την αναγνώριση και ταυτοποίηση μίας κηλίδας αίματος, σπέρματος ή μιας τρίχας.

PCR και λοιμώδεις νόσοι

Η χρήση της PCR στις λοιμώδεις νόσους επικεντρώθηκε αρχικά στη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων. Η εφαρμογή αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιμη δεδομένου ότι οι καλλιέργειες ιών είναι χρονοβόρες και πολλές φορές ανεπιτυχείς. Η τεχνική της PCR είναι ταχύτατη σε αντίθεση με τις κλασικές μεθόδους ανίχνευσης μετά από καλλιέργεια, ενώ η ευαισθησία ανίχνευσης της PCR είναι μεγαλύτερη ακόμη και από αυτή των ανοσοενζυμικών μεθόδων (ELISA). Επειδή η τεχνική της PCR δεν στηρίζεται στην ανίχνευση αντισωμάτων στο αίμα κατά των παθογόνων αιτίων, αλλά στην άμεση ανίχνευση του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού στο υπό εξέταση δείγμα, αφενός δεν παρουσιάζεται λανθάνοντας χρόνος ανίχνευσης του μικροοργανισμού, αφετέρου το αποτέλεσμα δεν επηρεάζεται από την ανοσολογική κατάσταση του ασθενούς. Χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους PCR έχουν ανιχνευθεί ιοί όπως ο Epstein-Bar (EBV), ο ιός θηλωμάτων ανθρώπου (human papilloma virus, HPV), ο ιός ανοσοανεπάρκειας ανθρώπου (human immunodeficiency virus, HIV), ο κυτταρομεγαλοϊός (cytomegalovirus, CMV), ο ιός απλού έρπητος (herpes simplex virus, HSV), οι ιοί της ηπατίτιδας B και C καθώς και άλλοι.

Η τεχνική της PCR έχει χρησιμοποιηθεί συχνά στην ανίχνευση ογκογόνων ιών όπως του EBV, ο οποίος σχετίζεται με το καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα. Η ανίχνευση του ιού αυτού μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως διαγνωστικός καρκινικός δείκτης σε πρωτοπαθές ή και μεταστατικό καρκίνωμα.

Ιδιαίτερα σημαντική είναι η συμβολή της PCR στη διάγνωση της φυματίωσης (mycobacterium tuberculosis). Η συνήθως μικρή ποσότητα του μυκοβακτηριδίου στα παθολογικά δείγματα δυσχεραίνει την ανίχνευση του με κλασικές μεθόδους. Η PCR επιτρέπει την ταχύτερη και ευκολότερη ανίχνευση του μικροοργανισμού, μία και η ευαισθησία ανίχνευσης φτάνει τους 10 βακίλους σε 106 ευκαρυοτικά κύτταρα.

PCR και νεοπλασία

Η τεχνική της PCR είναι η μοναδική τεχνική με την οποία μπορούν να καθοριστούν διάφορες μεταλλάξεις γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου ακόμη και σε μικροποσότητες καρκινικού δείγματος. Δεδομένου ότι η PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονιδιακές διαταραχές ακόμη και σε ένα νεοπλασματικό κύτταρο είναι φανερό ότι η πρώιμη διάγνωση των καρκίνων μπορεί να γίνει πιο εύκολα, επιφέροντας σημαντικά κοινωνικό-οικονομικά οφέλη.

Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως στην ανίχνευση ιών που σχετίζονται με κακοήθεις όγκους όπως ο HPV, ορισμένοι τύποι του οποίου (HPV-16, HPV-18) σχετίζονται με υψηλό κίνδυνο ανάπτυξης καρκινώματος του τραχήλου και της μήτρας, ο ανθρώπινος Τ-λεμφοτρόπος ιός (human T-leukocyte virus, HTLV-1) ο οποίος εμπλέκεται στην ανάπτυξη οξείας λευχαιμίας και ο ιός EBV ο οποίος έχει παθογενετική σημασία στην ανάπτυξη καρκινώματος του ρινοφάρυγγος και νόσου Hodgkin.

Επιπλέων, η PCR χρησιμοποιείται παράλληλα και στην ανίχνευση μεταλλάξεων σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Μερικά από τα πιο διαδεδομένα παραδείγματα είναι τα εξής:

α) Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια BRCA-1 και BRCA-2 (breast-associated cancer genes) ευθύνονται για την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού. Μεταλλάξεις των γονιδίων αυτών θεωρούνται υπεύθυνες για την κληρονομική προδιάθεση ανάπτυξης καρκινώματος μαστού και ωοθηκών.

β) Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, μεταλλάξεις του οποίου είναι πολύ συχνές σε πολλούς τύπους όγκων.

γ) Τα ογκογονίδια Ras και myc τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα.

PCR και γενετικές παθήσεις

Στον τομέα των γενετικών ασθενειών, η PCR είναι η πιο διαδεδομένη μέθοδος ανίχνευσης μεταλλάξεων και πολυμορφισμών. Σε γενετικές ανωμαλίες μάλιστα, όπου τα προϊόντων μεταλλαγμένων γονιδίων είναι πολύ δύσκολο να ανιχνευθούν, μόνο η ανάλυση του DNA μπορεί να φανεί χρήσιμη. Με την τεχνική της PCR μεταβολή ακόμη και μια μονάχα βάσης σε ένα γονίδιο μπορεί να ανιχνευθεί καθώς και να εξακριβωθεί αν πρόκειται για ομόζυγη ή ετερόζυγη μεταβολή. Μία από τις πιο σημαντικές εφαρμογές της PCR είναι στον προγεννητικό έλεγχο δείγματος αμνιακού υγρού ή χοριακών λάχνων για την ύπαρξη γενετικών ανωμαλιών, όπως μεταξύ άλλων αιμοσφαιρινοπάθειες, μεσογειακή αναιμία, κυστική ίνωση και θρομβοφιλική προδιάθεση.

Ίσως μέχρι σήμερα, ο νεότερος ειδικευμένος Ιατρός στην Ελλάδα. Από τον 4/1989 έως 4/1990 διετέλεσε υπηρεσία υπαίθρου στο Αγροτικό Ιατρείο Καμένων Βούρλων.Έκτοτε ιδιώτης κυτταρολόγος με ιατρεία σε αρκετές πόλεις της Ελλάδος. Από τους πρώτους στην Ευρώπη το 1992 που έκανε ταυτοποιήσεις ιών και μικροβίων (ΙΝ SITU υβριδισμό), εφάρμοσε την υγρή κυτταρολογία από το 1998, το ΤhinPrep Pap Test καθώς και όλες τις εξελίξεις της σύγχρονης ανοσοκυτταροχημείας, μοριακής κυτταρολογίας κ.ά.

lainisandreas@testpap.com